Integrin β2/ITGB2/CD18 CRISPR/Cas9 KOプラスミド (m): sc-421173

概要

Itgb2 はインテグリンβ2（CD18）をコードしており、αインテグリン（例：CD11a／CD11b／CD11c／CD11d）とペアを組んで、白血球特異的な接着受容体を形成する共通のβサブユニットです。これらの受容体は、強固な接着、血管外への遊走（トランスミグレーション）、免疫シナプス形成に必須です。ITGB2 を含むインテグリンは、細胞骨格リモデリング、ケモカイン依存的なトラフィッキング、貪食細胞機能を制御する外向き（outside-in）および内向き（inside-out）のシグナル伝達を協調し、FAK/Src、PI3K–AKT、MAPK、小型GTPアーゼなどの経路に関与します。マウス免疫生物学において Itgb2 活性は、骨髄系・リンパ系の各コンパートメントにまたがり、炎症部位への動員、宿主防御、免疫寛容の機構に影響します。β2インテグリン媒介の接着およびシグナル伝達の制御異常は、白血球の血管外遊走や活性化が障害される免疫不全、慢性炎症、自己免疫様病態のモデルと関連します。

Integrin β2/ITGB2/CD18 CRISPR/Cas9 KOプラスミド（m）は、mouse細胞株におけるItgb2遺伝子の標的破壊のために設計されたプラスミドのプールです。このプールに含まれる各プラスミドは、Streptococcus pyogenes Cas9 ヌクレアーゼとともに、Itgb2 遺伝子座内の異なる部位を標的とする固有の sgRNA を共発現し、蛍光による同定と、トランスフェクションに成功した細胞の濃縮を可能にする GFP をコードしています。このマルチガイド戦略は、機能的なノックアウトをもたらすフレームシフトや欠失を誘導する可能性を高め、シングルガイドアプローチに代わる、より堅牢な選択肢を提供します。複数の部位で誘導された二本鎖切断（DSB）は、非相同末端結合（NHEJ）によって修復されるか、または同梱のHDRドナーテンプレートと併用した場合、遺伝子座内の定義された標的部位で相同性依存修復（HDR）によって修復されます。

RFP発現HDRドナーと併用する場合、GFPとRFPの蛍光を併用して、トランスフェクトされた細胞集団と編集された細胞集団を区別できるため、フローサイトメトリーに基づく選別およびクローン選択のワークフローが効率化されます。

相同性依存修復（HDR）ドナー — RFPレポーター付きプロマイシンカセット

確認済みで選択可能なノックアウトクローンを必要とする用途向けに、Integrin β2/ITGB2/CD18 HDRプラスミド（m）には、定義されたItgb2ターゲット部位に特異的なホモロジーアームに挟まれた、プロマイシン耐性カセット（PuroR）および赤色蛍光タンパク質（RFP）レポーターを含むHDRドナー構築体が含まれています。
Integrin β2/ITGB2/CD18 CRISPR/Cas9 KOプラスミド（m）と共トランスフェクションした場合：

• PuroR-RFPカセットはHDRを介してCas9切断部位に組み込まれ、Itgb2のオープンリーディングフレームを破壊します。
  RFP蛍光は、組み込みの成功を即座に視覚的に示す指標となり、プテロマイシン選別前または選別と並行して、蛍光に基づく編集細胞の同定や選別を可能にします。
  編集に成功した細胞はプテロマイシン耐性によって確認されるため、クローンスクリーニングの負担を大幅に軽減します。
  この選別戦略は、下流の機能解析、薬剤スクリーニング、またはモデル開発のための安定したクローン性KO細胞株の作製に最適です。

Cre-loxカセット除去システム

このHDRドナー構築体には、PuroR-RFP選択カセットを挟むloxPサイトが組み込まれており、クローンの確認後にマーカーをきれいに除去することが可能です。同梱のCreベクター：sc-418923によるCreリコンビナーゼの一過性発現により、カセットが切除され、Itgb2遺伝子座内に最小限の残留loxPサイトが残るだけで、下流のアッセイに対する潜在的な交絡効果が排除されます。
この2段階のアプローチ：

• 局所的なクロマチン構造および近隣の調節要素への影響を最小限に抑えます
  編集された遺伝子座において、ほぼ天然の状態に近いゲノム環境を回復させます
  同じ細胞株において、さらなる編集のためにプロマイシン選別戦略を再利用可能にします

主な特徴

• Integrin β2/ITGB2/CD18の機能に不可欠なItgb2エクソンを標的とするgRNA
  デリバリーを簡素化するため、SpCas9とsgRNAを単一のプラスミドから共発現
  陽性クローン選別用のプロマイシン耐性HDRドナー
  シームレスなマーカー除去のためのCreリコンビナーゼベクターを備えたloxPで挟まれたPuroRカセット
  トランスフェクションによる導入用に即使用可能な状態で提供

研究用のみ。診断用または治療用ではありません。