INPP5E Particelle di Attivazione Lentivirale (h): sc-405923-LAC

INPP5E codifica l’inositolo polifosfato-5-fosfatasi E, una 5-fosfatasi dei fosfoinositidi che idrolizza PI(4,5)P2 e PI(3,4,5)P3 per modellare la composizione dei fosfoinositidi di membrana. INPP5E è arricchita nel ciglio primario e contribuisce all’identità della membrana ciliare, al traffico intracellulare e alla segnalazione, inclusa la modulazione dell’output della via Hedgehog e, più in generale, delle dinamiche di segnalazione lipidica legate all’asse PI3K–AKT. Controllando i gradienti di fosfoinositidi, INPP5E aiuta a coordinare la ciliogenesi, la localizzazione dei recettori e le risposte a valle dei secondi messaggeri. L’alterazione della funzione di INPP5E è associata a fenotipi da ciliopatia e a disturbi del neurosviluppo, rendendola un bersaglio rilevante per studi meccanicistici sulla segnalazione dipendente dalle ciglia e sulla regolazione dei lipidi di membrana.

Le particelle di attivazione lentivirale INPP5E (h) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di INPP5E in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale INPP5E (h) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione INPP5E, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di INPP5E. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo INPP5E e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.