Plasmide CRISPR d'Activation (h) IDO: sc-400495-ACT

L’IDO1 humain code l’indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO), une enzyme hème‑dépendante et limitante de la voie de la kynurénine, qui catalyse le clivage oxydatif du tryptophane en N‑formylkynurénine. En contrôlant la disponibilité locale du tryptophane et en générant des métabolites bioactifs de la kynurénine, IDO influence les réponses cellulaires au stress, la signalisation immunitaire et le dialogue métabolique au sein du microenvironnement tissulaire. L’expression d’IDO1 est inductible par des signaux inflammatoires, en particulier via des voies dépendantes des interférons, et elle est fréquemment étudiée dans des contextes où la régulation métabolique recoupe la présentation de l’antigène et les mécanismes de tolérance. Une activité d’IDO1 dérégulée a été associée à la biologie des maladies inflammatoires et aux interactions tumeur–système immunitaire, ce qui en fait un point nodal utile pour des études mécanistiques d’immunométabolisme.

IDO Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de IDO1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

IDO Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus IDO1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription IDO1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de IDO. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus IDO1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de IDO au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie IDO dans les cellules tumorales présentant une expression de IDO1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.