Hugl-1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403441-ACT

LLGL1 kodiert das menschliche Protein Hugl-1, einen konservierten Regulator der Polarität epithelialer Zellen und der Organisation der basolateralen Membran. Hugl-1 wirkt innerhalb apikal–basaler Polaritätsnetzwerke, die die Integrität von Zellkontakten, die asymmetrische Zellteilung und die Organisation des Zytoskeletts koordinieren und damit Gewebearchitektur und Differenzierung beeinflussen. Eine Störung der Polarititätskontrolle ist mit veränderter Migration und invasivem Verhalten verbunden, wodurch LLGL1 ein relevanter Knotenpunkt für Studien zur epithelialen Homöostase, Morphogenese und zum tumorassoziierten Verlust von Polarität ist. Expression und Lokalisation von LLGL1 werden zudem genutzt, um Signalweg-Crosstalk zwischen Polaritätsmodulen und Signalwegen zu untersuchen, die Proliferation und Zell‑Zell‑Adhäsion steuern.

Hugl-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LLGL1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Hugl-1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LLGL1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LLGL1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Hugl-1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LLGL1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Hugl-1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Hugl-1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LLGL1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.