HSPA6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400870-ACT

HSPA6 kodiert ein stressinduzierbares Mitglied der HSP70-Familie, das als ATP-abhängiges molekulares Chaperon wirkt, um neu gebildete oder geschädigte Proteine zu stabilisieren, deren Wiederfaltung zu fördern und während proteotoxischem Stress Aggregation zu verhindern. Es wird durch Hitzeschock und andere zelluläre Schädigungen rasch über durch Hitzeschockfaktoren vermittelte Transkriptionsprogramme hochreguliert und ist Teil von Proteostase-Netzwerken, die sich mit der unfolded protein response, dem Ubiquitin-Proteasom-abhängigen Abbau und der Autophagie überschneiden. Da es die Kapazität der Proteinkontrolle mitprägt, werden Veränderungen der HSPA6-Expression häufig im Kontext von oxidativem Stress, Entzündung und zellulärer Schädigung untersucht. Fehlregulierte Chaperon-Aktivität und gestörte Proteostase sind allgemein relevant für Neurodegeneration, Stressanpassung von Krebszellen und Modelle von Gewebeschädigung, wodurch HSPA6 in Studien zur Stressbiologie einen nützlichen Readout und Modulator darstellt.

HSPA6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen HSPA6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HSPA6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des HSPA6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der HSPA6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HSPA6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native HSPA6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HSPA6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HSPA6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem HSPA6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.