Hrs Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401501-ACT

Il gene umano **HGS** codifica per il substrato della tirosina chinasi regolato dal fattore di crescita degli epatociti (**Hrs**), un adattatore di smistamento endosomiale che coordina il traffico dei recettori attivati dipendente dall’ubiquitina. Hrs funziona all’interno del complesso **ESCRT-0** per riconoscere i carichi ubiquitinati e promuoverne lo smistamento nelle vescicole intraluminali dei corpi multivescicolari, contribuendo così a modellare la degradazione lisosomiale e l’attenuazione del segnale dei recettori. Attraverso il controllo dell’endocitosi, della maturazione endosomiale e del turnover delle proteine di membrana, Hrs influenza vie legate alla segnalazione dei fattori di crescita, alla dinamica dei recettori delle citochine e all’omeostasi cellulare. Alterazioni nello smistamento endosomiale e disfunzioni di ESCRT sono state associate alla persistenza di segnali oncogenici e a fenotipi neurodegenerativi, rendendo HGS/Hrs un nodo utile per studi meccanicistici sulla biologia delle malattie dipendente dal traffico intracellulare.

Hrs Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HGS senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Hrs Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HGS nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HGS, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Hrs. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HGS nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Hrs nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Hrs nelle cellule tumorali con espressione di HGS silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.