HNF-3γ CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401720-ACT

FOXA3 kodiert den hepatozytären Nuklearfaktor 3 Gamma (HNF-3γ), einen Forkhead-Box-Transkriptionsfaktor, der dabei hilft, endodermale Linienprogramme zu etablieren und aufrechtzuerhalten, und Gene reguliert, die an der epithelialen Differenzierung und der metabolischen Homöostase beteiligt sind. HNF-3γ ist Teil transkriptioneller Netzwerke, die die Zugänglichkeit von Chromatin sowie die Aktivität von Promotoren und Enhancern koordinieren, und überschneidet sich mit Signalwegen, die den Glukose- und Lipidstoffwechsel, die Leberfunktion und die Entwicklung des Gastrointestinaltrakts steuern. In menschlichen Zellen trägt die FOXA3-Aktivität zu Entscheidungen der Zellidentität und zu einer kontextabhängigen Umgestaltung genregulatorischer Schaltkreise bei. Eine fehlregulierte Expression von FOXA3/HNF-3γ oder nachgeschalteten transkriptionellen Programmen wurde mit veränderten Differenzierungszuständen und krankheitsrelevanten Phänotypen in der Leber- und Gastrointestinalbiologie in Verbindung gebracht, was FOXA3 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien macht.

HNF-3γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen FOXA3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

HNF-3γ Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des FOXA3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der FOXA3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen HNF-3γ-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native FOXA3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von HNF-3γ-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des HNF-3γ-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem FOXA3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.