Histone H2A.X CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400538-ACT

H2AFX kodiert die Histonvariante Histon H2A.X, einen zentralen Bestandteil des Chromatins, der als Reaktion auf DNA-Doppelstrangbrüche rasch an Ser139 phosphoryliert wird (γH2AX). Diese Modifikation initiiert die Signalgebung der DNA-Schadensantwort, indem sie Mediator- und Reparaturfaktoren rekrutiert und dadurch ATM/ATR-Kinasewege, Chromatin-Remodeling, Checkpoint-Aktivierung sowie die Reparatur über nicht-homologes End-Joining und homologe Rekombination koordiniert. Die Dynamik von H2A.X beeinflusst die Toleranz gegenüber Replikationsstress, die Telomerstabilität und genomweite Transkriptionsprogramme, die mit der Chromatinintegrität verknüpft sind. Eine Fehlregulation der H2AFX-assoziierten Signalgebung wird häufig im Kontext genomischer Instabilität, onkogenem Stress und der Empfindlichkeit gegenüber genotoxischen Einwirkungen untersucht.

Histone H2A.X Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen H2AFX-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Histone H2A.X Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des H2AFX-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der H2AFX-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Histone H2A.X-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native H2AFX-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Histone H2A.X-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Histone H2A.X-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem H2AFX-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.