HIF1a Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-420856-LAC

Il gene murino Hif1a codifica il fattore inducibile dall’ipossia 1 alfa (HIF1a), un fattore di trascrizione bHLH-PAS che si stabilizza in condizioni di bassa disponibilità di ossigeno e dimerizza con ARNT per coordinare l’adattamento cellulare all’ipossia. HIF1a regola, tramite elementi di risposta all’ipossia, geni coinvolti nel metabolismo glicolitico, nella segnalazione angiogenica, nell’eritropoiesi, nell’omeostasi del ferro e nella sopravvivenza cellulare, integrando input dalle vie PI3K–AKT–mTOR e MAPK. La sua attività è controllata dall’idrossilazione delle prolina e dall’ubiquitinazione dipendente da VHL, collegando il sensing dell’ossigeno alla proteostasi. Una segnalazione di HIF1a deregolata è ampiamente implicata nella biologia dell’ipossia tumorale, nelle risposte allo stress legate all’ischemia, nell’infiammazione cronica e nel rimodellamento metabolico, rendendolo un nodo centrale per studi meccanicistici dei programmi trascrizionali dipendenti dall’ossigeno.

Le particelle di attivazione lentivirale HIF1a (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Hif1a in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale HIF1a (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Hif1a, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di HIF1a. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Hif1a e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.