HCN2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405074-ACT

HCN2 codifica il canale 2 attivato dall’iperpolarizzazione e regolato da nucleotidi ciclici (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide–gated channel 2), una subunità formante il poro che conduce la corrente Ih e collega l’iperpolarizzazione della membrana a un flusso entrante depolarizzante di cationi. Integrando il rilevamento del voltaggio con la modulazione diretta da parte dei nucleotidi ciclici, HCN2 contribuisce a regolare l’eccitabilità neuronale, l’attività pacemaker e le proprietà di scarica ritmica, influenzando l’integrazione del segnale e le oscillazioni di rete. La funzione di HCN2 interseca la segnalazione associata a cAMP/PKA e programmi elettrofisiologici più ampi che modellano la responsività sinaptica e la regolazione genica dipendente dall’eccitabilità. Un’espressione o un’attività canalare di HCN2 deregolate sono state associate a fenotipi di eccitabilità alterati rilevanti per disturbi neurologici e del sistema sensoriale, a supporto di studi meccanicistici in tessuti eccitabili e in modelli cellulari pertinenti alla malattia.

HCN2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HCN2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HCN2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HCN2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HCN2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HCN2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HCN2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HCN2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HCN2 nelle cellule tumorali con espressione di HCN2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.