G_{α z} Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402241-ACT

GNAZ codifica la subunità alfa Gαz di una proteina G eterotrimerica inibitoria, un mediatore di segnalazione della famiglia Gi/o che accoppia specifici recettori accoppiati a proteine G (GPCR) alla soppressione dell’adenilato ciclasi e alla riduzione del cAMP intracellulare. Attraverso la regolazione della dinamica dei secondi messaggeri, Gαz influenza la segnalazione a valle mediata da PKA, la modulazione dei canali ionici e i programmi di fosforilazione che determinano l’eccitabilità neuronale, la secrezione e la desensibilizzazione dei recettori. L’attività di GNAZ si intreccia con vie di segnalazione sensibili a neurotrasmettitori e ormoni, e un’alterazione dell’accoppiamento GPCR–proteina G è stata implicata in fenotipi neuropsichiatrici, nella funzione piastrinica e in anomalie della segnalazione endocrina. In quanto distinta subunità Gα inibitoria insensibile alla PTX, Gαz rappresenta un nodo utile per analizzare una segnalazione inibitoria specifica del recettore rispetto ad altre proteine Gi.

Gα z Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GNAZ senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gα z Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GNAZ nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GNAZ, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gα z. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GNAZ nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gα z nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gα z nelle cellule tumorali con espressione di GNAZ silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.