Plásmido CRISPR de Activación (m) gp91phox: sc-419890-ACT

Cybb codifica gp91phox (NOX2), la subunidad catalítica de membrana del complejo NADPH oxidasa de los fagocitos, que impulsa la generación de especies reactivas de oxígeno durante el estallido respiratorio. En las células inmunitarias innatas del ratón, gp91phox se asocia con p22phox y con reguladores citosólicos como p47phox, p67phox y Rac para ensamblar un sistema de transporte de electrones que reduce el oxígeno a superóxido, favoreciendo la eliminación de microorganismos y la señalización dependiente del estado redox. Esta actividad influye en las vías inflamatorias, la función fagolisosomal y las respuestas al estrés oxidativo. La alteración o desregulación de Cybb/NOX2 se estudia ampliamente en modelos de inmunodeficiencia, inflamación crónica y daño tisular asociado al redox.

gp91phox El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Cybb sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

gp91phox El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Cybb en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Cybb, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de gp91phox. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Cybb y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de gp91phox en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía gp91phox en células tumorales con expresión de Cybb silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.