GITR Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404899-ACT

TNFRSF18 codifica a proteína relacionada ao TNFR induzida por glicocorticoides (GITR; CD357), um receptor coestimulatório da superfamília de receptores de TNF expresso em células T ativadas e de forma constitutiva em células T regulatórias. Após o engajamento, o GITR sinaliza por meio de adaptadores TRAF para ativar as vias canônica de NF-κB, MAPK e PI3K/AKT, influenciando a sobrevivência, a proliferação e a produção de citocinas pelas células T, ao mesmo tempo que modula programas supressores em Tregs. Esse eixo é amplamente estudado na homeostase imune e na sinalização inflamatória, com relevância para a imunologia tumoral, a autoimunidade e modelos de infecção, nos quais limiares alterados de ativação de células T e redes regulatórias contribuem para a fisiopatologia.

GITR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TNFRSF18 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

GITR O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TNFRSF18 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TNFRSF18, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de GITR. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TNFRSF18 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de GITR no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via GITR em células tumorais com expressão de TNFRSF18 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.