Plasmide CRISPR d'Activation (h) GHS-R1: sc-401724-ACT

GHSR code le récepteur sécrétagogue de l’hormone de croissance GHS‑R1, un RCPG (GPCR) de classe A sensible à la ghréline, qui régule la signalisation endocrinienne et neurométabolique. Lors de la liaison du ligand, GHS‑R1 se couple principalement à Gq/11 pour stimuler la phospholipase C, le renouvellement des inositol phosphates, la mobilisation du Ca2+ intracellulaire et les voies en aval associées à MAPK/ERK et à PI3K, avec en plus une communication croisée via l’échafaudage assuré par la β‑arrestine. Ce récepteur intègre la détection des nutriments à l’activité de l’axe hypothalamo‑hypophysaire, influençant la régulation de l’appétit, la libération d’hormone de croissance et l’homéostasie énergétique. Des altérations de l’expression ou de la signalisation de GHSR ont été impliquées dans des traits liés à l’obésité, une dérégulation métabolique et des phénotypes endocriniens, ce qui étaye son utilisation comme cible mécanistique en pharmacologie des récepteurs et dans l’étude des réseaux de signalisation.

GHS-R1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GHSR sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GHS-R1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GHSR dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GHSR, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GHS-R1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GHSR natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GHS-R1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GHS-R1 dans les cellules tumorales présentant une expression de GHSR silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.