GFAT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403022-ACT

Das humane Gen **GFPT1** kodiert die Glutamin—Fructose-6-phosphat-Amidotransferase 1 (GFAT1), das geschwindigkeitsbestimmende Enzym des Hexosamin-Biosynthesewegs, der Fructose-6-phosphat und Glutamin zu Glucosamin-6-phosphat umsetzt und dadurch die zellulären UDP-GlcNAc-Pools kontrolliert. Durch die Regulation der Substratverfügbarkeit für N- und O-gebundene Glykosylierung beeinflusst GFAT1 die Proteostase, den Membrantransport und an den Nährstoffstatus gekoppelte Signalprogramme. Die GFPT1-Aktivität verknüpft den Glukose- und Aminosäurestoffwechsel mit stressadaptiven Signalwegen, einschließlich ER-Homöostase und Redox-Gleichgewicht, und moduliert O-GlcNAcylierungsabhängige transkriptionelle sowie zytoskelettale Dynamiken. Eine veränderte GFPT1-Funktion wurde mit kongenitalen myasthenischen Syndromen in Verbindung gebracht und im Kontext metabolischer Umprogrammierung sowie von Glykosylierungsänderungen untersucht, die in vielfältigen krankheitsrelevanten zellulären Zuständen beobachtet werden.

GFAT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen GFPT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GFAT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des GFPT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der GFPT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GFAT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native GFPT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GFAT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GFAT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem GFPT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.