GCP5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404740-ACT

TUBGCP5 kodiert das Gamma‑Tubulin‑Komplexprotein 5 (GCP5), eine Kernkomponente des Gamma‑Tubulin‑Ringkomplexes, der Mikrotubuli an Zentrosomen und anderen Mikrotubuli‑organisierenden Zentren nucleiert. Indem GCP5 den Spindelaufbau und die Zentrosomenfunktion unterstützt, trägt es zu einer zuverlässigen Chromosomensegregation und zum Fortschreiten durch die Mitose bei. Störungen von Untereinheiten des Gamma‑TuRC können die Mikrotubuli‑Dynamik beeinträchtigen und zu Zentrosomenanomalien sowie Aneuploidie führen – Prozesse, die häufig im Kontext von Genominstabilität und Tumorbiologie untersucht werden. Eine veränderte TUBGCP5‑Expression oder Kopienzahl wurde in krebsassoziierten Datensätzen beschrieben, was das Gen für Untersuchungen zu mitotischen Stressantworten und Zellzyklus‑Checkpoints relevant macht.

GCP5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen TUBGCP5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

GCP5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des TUBGCP5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der TUBGCP5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen GCP5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native TUBGCP5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von GCP5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des GCP5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem TUBGCP5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.