Gastrin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403220-ACT

Il gene umano GAST codifica la gastrina, un ormone peptidico prodotto principalmente dalle cellule G gastriche che regola la secrezione di acido gastrico, la crescita della mucosa e la motilità gastrointestinale. La gastrina segnala soprattutto attraverso il recettore della colecistochinina B (CCKBR), attivando vie intracellulari quali PLC/PKC, MAPK/ERK e la segnalazione calcio-dipendente, per modulare la proliferazione epiteliale e i programmi secretori. Un’espressione deregolata della gastrina e un’alterata segnalazione gastrina–CCKBR sono state associate al rimodellamento della mucosa gastrica legato all’ipergastrinemia e a perturbazioni più ampie dell’omeostasi endocrina dell’apparato digerente. In quanto marcatore e regolatore della funzione endocrina gastrica, GAST è frequentemente studiato in modelli di fisiologia gastrica, segnalazione associata all’infiammazione e differenziamento epiteliale.

Gastrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GAST senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Gastrin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GAST nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GAST, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Gastrin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GAST nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Gastrin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Gastrin nelle cellule tumorali con espressione di GAST silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.