Plasmide CRISPR d'Activation (h) GAP1-InsP₄ BP: sc-403002-ACT

RASA3 code la protéine d’activation de la GTPase Ras GAP1‑InsP4 BP, un facteur régulateur qui accélère l’hydrolyse du GTP sur les petites GTPases de la famille Ras afin de moduler l’amplitude et la durée des signaux. Grâce à sa sensibilité aux polyphosphates d’inositol, GAP1‑InsP4 BP intègre des signaux de seconds messagers liés aux phosphoinositides avec des voies dépendantes de Ras qui contrôlent la prolifération, la différenciation, la dynamique du cytosquelette et le trafic vésiculaire. L’activité de RASA3 est impliquée dans la biologie hématopoïétique et vasculaire, où une régulation altérée des petites GTPases peut perturber la fonction plaquettaire, la signalisation endothéliale et les programmes de développement. La dérégulation du contrôle des voies Ras est largement pertinente dans la signalisation oncogénique et d’autres troubles caractérisés par une activité aberrante des réseaux MAPK/PI3K, ce qui fait de RASA3 un nœud utile pour des études mécanistiques de la transduction du signal.

GAP1-InsP4 BP Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RASA3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GAP1-InsP4 BP Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RASA3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RASA3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GAP1-InsP4 BP. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RASA3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GAP1-InsP4 BP au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GAP1-InsP4 BP dans les cellules tumorales présentant une expression de RASA3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.