Plasmide CRISPR d'Activation (h) GALT: sc-405717-ACT

La GALT humaine (galactose-1-phosphate uridylyltransférase) est une enzyme cytosolique de la voie de Leloir qui catalyse la conversion du galactose-1-phosphate et de l’UDP-glucose en glucose-1-phosphate et UDP-galactose, contribuant à l’utilisation cellulaire des glucides et à l’homéostasie des sucres activés de type UDP. En maintenant des pools équilibrés de métabolites du galactose et de sucres nucléotidiques, la GALT influence la capacité de glycosylation et, plus largement, la stabilité des réseaux métaboliques. Une altération de l’activité de la GALT est classiquement associée aux phénotypes de galactosémie et constitue un modèle bien défini pour étudier les réponses au stress métabolique ainsi que les effets en aval sur la biosynthèse des macromolécules. Dans les systèmes expérimentaux, la modulation de l’expression de la GALT est utilisée pour explorer la prise en charge du galactose, les voies de glycosylation dépendantes des sucres UDP et les vulnérabilités métaboliques dans des conditions nutritionnelles définies.

GALT Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GALT sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

GALT Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GALT dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GALT, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de GALT. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GALT natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de GALT au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie GALT dans les cellules tumorales présentant une expression de GALT silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.