G6PD CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401019-ACT

Das humane G6PD-Gen kodiert die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym des oxidativen Pentosephosphatwegs, der NADPH für die reduktive Biosynthese und die antioxidative Abwehr bereitstellt. Durch die Aufrechterhaltung des Glutathion-Redoxzyklus und den Schutz vor reaktiven Sauerstoffspezies unterstützt G6PD zelluläre Antworten auf oxidativen und metabolischen Stress, insbesondere in Erythrozyten und anderen Umgebungen mit hoher oxidativer Belastung. Die G6PD-Aktivität beeinflusst die Nukleotidbiosynthese über die Produktion von Ribose-5-phosphat und steht in Wechselwirkung mit Signal- und Stoffwechselwegen, die Proliferation, Entzündung und die Empfindlichkeit gegenüber Ferroptose steuern. Genetische oder funktionelle Störungen von G6PD sind mit einer erhöhten Hämolyseanfälligkeit unter oxidativer Belastung assoziiert und werden aufgrund ihres Einflusses auf die Redoxhomöostase in vielfältigen krankheitsrelevanten Kontexten intensiv untersucht.

G6PD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen G6PD-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

G6PD Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des G6PD-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der G6PD-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen G6PD-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native G6PD-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von G6PD-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des G6PD-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem G6PD-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.