G530011O06Rik Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-437289-ACT

Il gene murino G530011O06Rik codifica la proteina G530011O06Rik, un fattore scarsamente caratterizzato con annotazioni funzionali limitate nelle attuali banche dati di pathway. Le evidenze disponibili suggeriscono che possa partecipare a processi cellulari fondamentali come la regolazione trascrizionale, il metabolismo dell’RNA o altri programmi regolatori dipendenti dal contesto, rendendolo rilevante per studi a livello di sistema sull’architettura delle reti geniche. Poiché i geni della collezione di cDNA RIKEN spesso rappresentano trascritti responsivi al lignaggio o allo stimolo, la modulazione dell’espressione di G530011O06Rik può aiutare a chiarire le transizioni di stato cellulare, le risposte allo stress e i programmi di sviluppo. Definirne il ruolo endogeno può orientare la ricerca meccanicistica in modelli rilevanti per la malattia in cui una disregolazione dell’espressione genica contribuisce a fenotipi patologici, senza implicare un’utilità clinica.

G530011O06Rik Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di G530011O06Rik senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

G530011O06Rik Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus G530011O06Rik nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione G530011O06Rik, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di G530011O06Rik. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus G530011O06Rik nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da G530011O06Rik nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via G530011O06Rik nelle cellule tumorali con espressione di G530011O06Rik silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.