Plasmide CRISPR d'Activation (h) fumarate hydratase: sc-401660-ACT

Le gène humain **FH** code la **fumarate hydratase** (fumarase), une enzyme homotétramérique du cycle de l’acide tricarboxylique (cycle de Krebs, TCA) qui catalyse l’hydratation réversible du fumarate en **L‑malate**, reliant le métabolisme énergétique mitochondrial à l’anaplérose et à l’homéostasie redox. Au-delà des flux centraux du carbone, les niveaux de fumarate influencent la signalisation cellulaire via la succination des protéines et la modulation de programmes épigénétiques et associés à l’hypoxie, reliant l’activité de FH aux réponses au stress mitochondrial et au remodelage métabolique. L’altération de la fonction de FH a été associée au métabolisme oncogénique et à une gestion modifiée des espèces réactives de l’oxygène, faisant de FH un nœud clé pour l’étude de la dysfonction mitochondriale, des points de contrôle métaboliques et des relations génome‑métabolite dans les cellules humaines.

fumarate hydratase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FH sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

fumarate hydratase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FH dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FH, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de fumarate hydratase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FH natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de fumarate hydratase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie fumarate hydratase dans les cellules tumorales présentant une expression de FH silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.