Plasmide CRISPR d'Activation (h) frizzled: sc-401592-ACT

FZD2 code le récepteur humain Frizzled-2, un récepteur Wnt à sept domaines transmembranaires qui se lie aux ligands Wnt et coordonne la signalisation en aval via les voies dépendantes de la β-caténine (canoniques) et celles de la polarité planaire des cellules/Ca2+ (non canoniques). En régulant des programmes transcriptionnels, la dynamique du cytosquelette et la polarité cellulaire, FZD2 contribue à la mise en place des patrons développementaux, au comportement des cellules souches/progénitrices et à l’homéostasie tissulaire. Des altérations de la signalisation Wnt–Frizzled impliquant FZD2 ont été associées à une prolifération aberrante, à l’invasion et à la transition épithélio-mésenchymateuse dans de nombreux contextes pathologiques, ce qui en fait une cible fréquente pour des études mécanistiques sur le remodelage des voies de signalisation.

frizzled-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de FZD2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

frizzled-2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus FZD2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription FZD2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de frizzled-2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus FZD2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de frizzled-2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie frizzled-2 dans les cellules tumorales présentant une expression de FZD2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.