FLIP_S/L CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400400-ACT

CFLAR kodiert das zelluläre FLICE-inhibitorische Protein (FLIP), das in den Isoformen FLIP_S und FLIP_L exprimiert wird und die durch Todesrezeptoren initiierte Apoptose und Nekroptose moduliert. Durch die Interaktion mit FADD und Prokaspase-8 am death-inducing signaling complex (DISC) stimmt FLIP die Aktivierung von Kaspase-8 ab und beeinflusst damit die Signaloutputs der TNF-, Fas/CD95- und TRAIL-Wege sowie die nachgeschaltete NF-κB-Signalgebung. Über diese regulatorische Funktion wirkt sich CFLAR auf zelluläre Überlebensentscheidungen, inflammatorische Signalübertragung und die Immunhomöostase aus. Eine veränderte CFLAR/FLIP-Expression wird mit einer dysregulierten Apoptoseresistenz und immunassoziierten Pathologien in Verbindung gebracht, weshalb es in Studien zu Tumorzellüberleben, Infektionsantworten und zytokingetriebener Stresssignalgebung häufig als zentraler Knotenpunkt im Fokus steht.

FLIPS/L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CFLAR-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

FLIPS/L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CFLAR-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CFLAR-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen FLIPS/L-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CFLAR-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von FLIPS/L-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des FLIPS/L-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CFLAR-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.