Erythropoietin/EPO CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400283-ACT

EPO kodiert Erythropoietin, ein sezerniertes glykosyliertes Proteohormon, das das Überleben, die Proliferation und die Differenzierung erythroider Vorläuferzellen vor allem über die Bindung an EPOR und die nachgeschaltete JAK2/STAT5-Signalgebung reguliert, mit zusätzlichen Beiträgen der PI3K/AKT- und MAPK-Signalwege. Seine Expression wird streng durch Sauerstoffsensorik-Mechanismen kontrolliert, insbesondere durch HIF-abhängige transkriptionelle Regulation, die hypoxischen Stress mit der Erythropoese koppelt. Eine fehlregulierte EPO/EPOR-Signalgebung und veränderte Sauerstoffantwort-Programme sind relevant für die Biologie der Anämie, Polyzythämie und tumorhypoxieassoziierte Anpassungen und werden häufig in hämatopoetischen, renalen und Krebs-Modellsystemen untersucht. EPO wird außerdem als Readout für die Aktivität von Hypoxie-Signalwegen und als Marker für Zellzustandsänderungen verwendet, die die endokrine Zytokinsekretion beeinflussen.

Erythropoietin/EPO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EPO-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Erythropoietin/EPO Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EPO-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EPO-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Erythropoietin/EPO-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EPO-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Erythropoietin/EPO-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Erythropoietin/EPO-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EPO-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.