Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ero1-Lα: sc-401747-ACT

L’ERO1A humain code l’Ero1‑Lα, une oxydoréductase du réticulum endoplasmique (RE) qui favorise le repliement oxydatif des protéines en réoxydant la protéine disulfure isomérase (PDI) et en promouvant la formation de ponts disulfure. En se couplant au réseau redox du RE, Ero1‑Lα influence l’homéostasie du RE, le flux de la voie de sécrétion et la réponse aux protéines mal repliées (UPR) en conditions de stress protéostatique. Son activité contribue à la signalisation redox via une production régulée d’espèces réactives de l’oxygène et s’inscrit à l’interface de voies contrôlant l’adaptation à l’hypoxie et le métabolisme cellulaire. Une expression altérée d’ERO1A a été associée à la biologie tumorale, aux réponses au stress inflammatoire et à des maladies caractérisées par un stress du RE et un mauvais repliement des protéines.

Ero1-Lα Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de ERO1A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ero1-Lα Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus ERO1A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription ERO1A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ero1-Lα. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus ERO1A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ero1-Lα au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ero1-Lα dans les cellules tumorales présentant une expression de ERO1A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.