ERF Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403877-ACT

O ERF (ETS2 repressor factor) é um represssor transcricional humano da família ETS que se liga a motivos ETS para modular programas gênicos que controlam a progressão do ciclo celular, a diferenciação e a apoptose. A atividade do ERF é regulada por fosforilação dependente de MAPK/ERK, o que influencia sua localização subcelular e sua atividade transcricional, conectando sinais extracelulares de crescimento ao controle transcricional no núcleo. Ao restringir a transcrição dirigida por ETS, o ERF contribui para a regulação homeostática da proliferação e da especificação de linhagens, processos frequentemente perturbados em contextos de sinalização oncogênica. A desregulação de redes dependentes de ERF tem sido associada a alterações na responsividade a fatores de crescimento e a estados transcricionais aberrantes relevantes para a biologia do câncer e para distúrbios do desenvolvimento.

ERF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ERF sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ERF O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ERF em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ERF, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ERF. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ERF nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ERF no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ERF em células tumorais com expressão de ERF silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.