EpoR Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400442-ACT

EPOR codifica il recettore umano dell’eritropoietina (EpoR), un recettore di citochine di tipo I che regola la sopravvivenza, la proliferazione e la differenziazione della linea eritroide in risposta all’eritropoietina. L’attivazione del recettore dipendente dal ligando promuove la fosforilazione di JAK2 e la segnalazione a valle mediata da STAT5, con ulteriori interazioni (crosstalk) con le vie PI3K–AKT e MAPK che coordinano il supporto metabolico e programmi anti-apoptotici. Alterazioni della segnalazione di EPOR sono state collegate a un’eritropoiesi deregolata e a stati aberranti di segnalazione citochinica, rendendolo un nodo utile per lo studio della biologia dei recettori ematopoietici e della dinamica della trasduzione del segnale.

EpoR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di EPOR senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EpoR Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus EPOR nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione EPOR, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EpoR. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus EPOR nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EpoR nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EpoR nelle cellule tumorali con espressione di EPOR silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.