ephrin-A5 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402127-ACT

EFNA5 kodiert Ephrin-A5, einen über Glycosylphosphatidylinositol (GPI) membranverankerten Liganden für EphA-Rezeptor-Tyrosinkinasen, der kontaktabhängige Signalübertragung an der Zelloberfläche vermittelt. Interaktionen zwischen Ephrin-A5 und EphA koordinieren Axonführung, Synapsenbildung und die Etablierung von Gewebegrenzen, indem sie über Signalwege wie Rho-Familien-GTPasen, MAPK/ERK- und PI3K-Signalisierung die Zytoskelettdynamik, Zelladhäsion sowie repulsive bzw. attraktive Migrationssignale regulieren. In nicht-neuronalen Kontexten trägt EFNA5 über bidirektionale Eph/Ephrin-Signalisierung zu epithelial-mesenchymalen Eigenschaften, vaskulärer Musterbildung und zur Modulation des Tumormikromilieus bei. Eine fehlregulierte Aktivität des Eph/Ephrin-Signalwegs, einschließlich veränderter EFNA5-Expression, wurde in Krebsmodellen mit aberranter Zellmotilität und Invasivität sowie mit neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht, die für den Aufbau neuronaler Schaltkreise relevant sind.

ephrin-A5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen EFNA5-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ephrin-A5 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des EFNA5-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der EFNA5-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ephrin-A5-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native EFNA5-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ephrin-A5-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ephrin-A5-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem EFNA5-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.