Plásmido CRISPR de Activación (h) ephrin-A3: sc-402771-ACT

EFNA3 codifica la efrina-A3, un ligando anclado por glicosilfosfatidilinositol (GPI) para las tirosina quinasas receptoras EphA, que media la comunicación célula–célula dependiente de contacto. La señalización efrina-A3/EphA regula la remodelación del citoesqueleto, la adhesión celular y la migración direccional, influyendo en la formación de límites tisulares, la guía axonal y el patrón vascular a través de vías que incluyen las GTPasas de la familia Rho y programas dependientes de MAPK. En sistemas de mamíferos, las alteraciones de la señalización efrina–Eph se han relacionado con cambios en la conectividad neuronal, el remodelado angiogénico y fenotipos invasivos en múltiples contextos de enfermedad, lo que convierte a EFNA3 en un nodo útil para estudiar la señalización del microambiente. Por lo tanto, la actividad de EFNA3 humana es relevante para dilucidar cómo las señales ancladas a la membrana moldean la diferenciación, la motilidad y la organización tisular.

ephrin-A3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de EFNA3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ephrin-A3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus EFNA3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional EFNA3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ephrin-A3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo EFNA3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ephrin-A3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ephrin-A3 en células tumorales con expresión de EFNA3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.