EphB3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403039-ACT

EPHB3 codifica o receptor tirosina-quinase EphB3, um membro do sistema de sinalização Eph/ephrin que medeia a comunicação dependente de contato entre células vizinhas. O EphB3 participa de sinalização bidirecional que coordena a adesão celular, o remodelamento do citoesqueleto, a migração e a formação de fronteiras durante o desenvolvimento e a organização tecidual. Por meio de interações com ligantes ephrin-B, o EphB3 influencia vias que regulam a orientação axonal e a arquitetura epitelial, com efeitos a jusante sobre as GTPases da família Rho e redes de fosforilação relacionadas. A desregulação da sinalização de EphB3 tem sido associada a alterações no posicionamento celular e comportamento invasivo na biologia do câncer e a mudanças no padrão de circuitos neurais em contextos de neurodesenvolvimento.

EphB3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de EPHB3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

EphB3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus EPHB3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição EPHB3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de EphB3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus EPHB3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de EphB3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via EphB3 em células tumorais com expressão de EPHB3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.