Plasmide CRISPR d'Activation (h) Epac: sc-401807-ACT

RAPGEF3 code Epac (exchange protein directement activée par l’AMPc), un facteur d’échange de nucléotides guanyliques qui relie la signalisation de l’AMPc à l’activation des petites GTPases Rap1 et Rap2. Via un contrôle dépendant de Rap de l’affinité des intégrines, de la stabilité des jonctions cellule–cellule et de la dynamique du cytosquelette, Epac régule l’adhérence, la migration, la fonction de barrière et le trafic vésiculaire dans de nombreux types cellulaires. La signalisation d’Epac s’entrecroise avec des voies de l’AMPc indépendantes de la PKA et s’intègre aux réseaux régulateurs MAPK et PI3K pour moduler la prolifération et les réponses au stress. Une activité dérégulée de RAPGEF3/Epac a été impliquée dans des processus pertinents pour l’invasion des cellules cancéreuses, des phénotypes cardiovasculaires et inflammatoires, ainsi que le contrôle métabolique, ce qui en fait un nœud utile pour des études mécanistiques de voies de signalisation.

Epac Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RAPGEF3 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Epac Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RAPGEF3 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RAPGEF3, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Epac. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RAPGEF3 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Epac au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Epac dans les cellules tumorales présentant une expression de RAPGEF3 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.