Plásmido CRISPR de Activación (m) EN1/Engrailed 1: sc-420171-ACT

El gen En1 del ratón codifica EN1/Engrailed 1, un factor de transcripción homeobox que establece la identidad posicional y regula programas de patrón durante el desarrollo embrionario, con funciones destacadas en la formación del límite mesencéfalo–rombencéfalo y en la morfogénesis del cerebelo. EN1 modula redes de expresión génica que controlan la especificación neuronal, la guía axonal y la diferenciación regional, e interactúa con ejes de señalización del desarrollo como Wnt, FGF, BMP y SHH, que coordinan decisiones de destino del neuroepitelio. En tejidos posnatales, EN1 contribuye al mantenimiento neuronal y a la función de los circuitos, lo que lo hace relevante para estudios de fenotipos del neurodesarrollo, vulnerabilidad neuronal y desregulación transcripcional. La expresión alterada de EN1 se ha investigado en modelos de malformaciones del desarrollo y en contextos en los que factores de transcripción que especifican linaje son cooptados en programas de regulación génica asociados a enfermedades.

EN1/Engrailed 1 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de En1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

EN1/Engrailed 1 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus En1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional En1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de EN1/Engrailed 1. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo En1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de EN1/Engrailed 1 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía EN1/Engrailed 1 en células tumorales con expresión de En1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.