Elongin A Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404668-ACT

ELOA codifica a Elongin A humano, um fator de elongação da transcrição que aumenta a processividade da RNA polimerase II e sustenta a síntese eficiente de mRNA ao longo de genes transcritos ativamente. Elongin A também participa de vias de controle de qualidade dependentes de ubiquitina ao se associar a complexos Elongin que ajudam a regular a degradação de maquinarias de transcrição emperradas, conectando o estresse transcricional à proteostase. Por meio dessas funções, ELOA contribui para programas de expressão gênica que governam a progressão do ciclo celular, respostas a danos no DNA e a adaptação ao estresse celular. A desregulação da elongação da transcrição e de mecanismos de controle mediados por ubiquitina envolvendo Elongin A tem sido implicada em contextos relevantes para programas transcricionais oncogênicos e defeitos de manutenção do genoma, tornando-o um alvo útil para estudos mecanísticos.

Elongin A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ELOA sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Elongin A O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ELOA em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ELOA, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Elongin A. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ELOA nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Elongin A no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Elongin A em células tumorais com expressão de ELOA silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.