EGFL7 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-436135-ACT

Egfl7 kodiert den epidermal-growth-factor‑ähnlichen Domänenfaktor 7 (EGFL7), ein sezerniertes, mit der extrazellulären Matrix assoziiertes Protein, das in Endothelzellen angereichert ist und die Gefäßentwicklung sowie das angiogene Remodeling unterstützt. EGFL7 ist an der Migration von Endothelzellen, der Röhrenbildung und der Stabilisierung von Gefäßen beteiligt und wurde mit der Modulation der Zell‑Zell‑ und Zell‑Matrix‑Signalübertragung in Verbindung gebracht, einschließlich Effekten auf die Aktivität des Notch-Signalwegs während der sprossenden Angiogenese. In Mausmodellen stört eine veränderte Egfl7-Expression die Gefäßmusterbildung und das Verhalten von Endothelzellen, was das Gen in Signalwege einordnet, die für Reaktionen auf ischämische Schäden und tumorassoziierte Neovaskularisation relevant sind. Eine Fehlregulation von EGFL7 wurde außerdem im Kontext inflammatorischer Mikroumgebungen und des Gewebeumbaus untersucht, bei denen eine endotheliale Dysfunktion zu Krankheitsphänotypen beiträgt.

EGFL7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Egfl7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

EGFL7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Egfl7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Egfl7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen EGFL7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Egfl7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von EGFL7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des EGFL7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Egfl7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.