Dynamin II CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401037-ACT

DNM2 kodiert das humane Dynamin II, eine große GTPase, die bei der clathrinvermittelten Endozytose und anderen vesikulären Transportprozessen die Membranspaltung katalysiert. Dynamin II wirkt dabei mit dem Actin-Remodeling, BAR-Domänen-Proteinen und Adapterkomplexen zusammen, um die Internalisierung von Rezeptoren, das Recycling synaptischer Vesikel und die endosomale Sortierung zu regulieren. Dadurch prägt es Signalausgänge und die Membranhomöostase. Über seine Funktionen in der Membrandynamik beeinflusst DNM2 zudem Prozesse wie die Zytokinese und die Verteilung von Organellen und verknüpft so die Kontrolle endozytotischer Vorgänge mit der allgemeinen Zellphysiologie. Eine veränderte DNM2-Aktivität oder -Regulation wird mit neuromuskulären und neuroentwicklungsbezogenen Phänotypen in Verbindung gebracht und wird häufig hinsichtlich ihres Einflusses auf den Rezeptortransport und die Modulation nachgeschalteter Signalwege untersucht.

Dynamin II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DNM2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dynamin II Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DNM2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DNM2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dynamin II-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DNM2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dynamin II-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dynamin II-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DNM2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.