Dynamin I Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401183-ACT

Il gene umano **DNM1** codifica la **dynamina I**, una grande GTPasi che catalizza la scissione di membrana durante l’endocitosi mediata da clatrina e il riciclo delle vescicole sinaptiche. Assemblandosi in polimeri elicoidali a livello del colletto delle vescicole e accoppiando l’idrolisi del GTP alla costrizione della membrana, la dynamina I favorisce un rapido turnover delle vescicole e un traffico efficiente delle proteine di membrana. La funzione di **DNM1** interseca reti di adattatori endocitici, il rimodellamento dell’actina e processi di trasporto vescicolare che modellano la comunicazione neuronale e l’omeostasi di membrana. Alterazioni genetiche o una disregolazione di **DNM1** sono state associate a fenotipi neuroevolutivi e legati alle crisi epilettiche, rendendolo un nodo utile per studiare l’eccitabilità neuronale e la funzione sinaptica.

Dynamin I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DNM1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Dynamin I Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DNM1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DNM1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Dynamin I. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DNM1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Dynamin I nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Dynamin I nelle cellule tumorali con espressione di DNM1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.