DNA pol δ 3 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h2): sc-411506-ACT-2

O POLD3 humano codifica a subunidade 3 da DNA polimerase delta (DNA pol δ 3), um componente acessório do holoenzima polimerase δ que aumenta a síntese processiva de DNA e dá suporte à replicação da fita retardada dependente de PCNA. O POLD3 contribui para a manutenção do genoma por meio de funções no reparo do DNA e na tolerância a danos, incluindo a ressíntese de DNA durante a recombinação homóloga e outros processos de reparo associados à replicação que estabilizam forquilhas de replicação estagnadas. A interrupção da função de POLD3 tem sido associada a estresse replicativo, aumento da carga mutacional e instabilidade genômica observados em múltiplos contextos de câncer, tornando-o relevante para estudos de evolução tumoral e de dependências de reparo do DNA. Ferramentas de edição gênica direcionadas a POLD3 são úteis para dissecar vias de reparo acopladas à replicação, mapear interações de letalidade sintética dentro da rede de resposta a danos no DNA e comparar efeitos sobre a progressão do ciclo celular e a integridade do genoma em modelos de células humanas.

DNA pol δ 3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de POLD3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

DNA pol δ 3 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h2) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus POLD3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição POLD3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de DNA pol δ 3. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus POLD3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de DNA pol δ 3 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via DNA pol δ 3 em células tumorais com expressão de POLD3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.