DNA Ligase III CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402841-ACT

Das humane Gen **LIG3** kodiert die DNA-Ligase III, eine ATP-abhängige Ligase, die wesentlich dafür ist, DNA-Einzelstrangbrüche während der Basenexzisionsreparatur zu verschließen und Reparaturintermediate im alternativen End-Joining aufzulösen. Durch ihre Funktionen im Zellkern und in den Mitochondrien trägt die DNA-Ligase III zur Aufrechterhaltung der Genomintegrität, zur Erhaltung der mitochondrialen DNA und zum zellulären Überleben unter oxidativem sowie replikationsassoziiertem Stress bei. Die LIG3-Aktivität ist in PARP1- und XRCC1-assoziierte Reparaturkomplexe eingebunden und beeinflusst Mutationsausgänge, wenn die homologe Rekombination eingeschränkt ist. Eine dysregulierte LIG3-Expression oder eine Abhängigkeit von LIG3-vermittelter Reparatur wurde mit Phänotypen genomischer Instabilität in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und Modelle neurodegenerativer Erkrankungen relevant sind.

DNA Ligase III Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen LIG3-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DNA Ligase III Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des LIG3-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der LIG3-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DNA Ligase III-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native LIG3-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DNA Ligase III-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DNA Ligase III-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem LIG3-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.