DMBT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402615-ACT

DMBT1 (deleted in malignen Hirntumoren 1) kodiert ein sezerniertes, cysteinreiches Glykoprotein der Scavenger-Rezeptor-Familie, das an der epithelialen Differenzierung und der angeborenen mukosalen Immunität beteiligt ist. Das Protein wirkt an Wirt–Mikroben-Interaktionen mit, indem es pathogenassoziierte Liganden bindet, und trägt zur Aufrechterhaltung der Barrierefunktion bei, u. a. über Rollen in der Organisation der extrazellulären Matrix und der Regulation von Entzündungen. Die DMBT1-Expression wird während Gewebeschädigung und -reparatur moduliert und mit Programmen des epithelialen Remodellings in Verbindung gebracht. Eine veränderte Regulation von DMBT1 wurde bei mehreren Krebsarten und entzündlichen Erkrankungen beschrieben, was seine Nutzung als molekularen Ansatzpunkt zur Untersuchung der Tumor–Mikroumgebungs-Kommunikation und mukosaler Abwehrwege unterstützt.

DMBT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DMBT1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DMBT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DMBT1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DMBT1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DMBT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DMBT1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DMBT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DMBT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DMBT1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.