DENND5B CRISPR Activation Plasmid (h): sc-414817-ACT

DENND5B kodiert ein Protein mit DENN-Domäne, das an der Regulation des Rab-GTPase-abhängigen Membrantransports beteiligt ist und die Koordination von Vesikelknospung, endosomalem Transport und kompartimentierter Signalübertragung unterstützt. Durch die Beeinflussung des Zyklus kleiner GTPasen und der Fracht-/Cargo-Sortierung kann DENND5B den Rezeptorumsatz, die intrazelluläre Proteinlokalisation und übergeordnete zelluläre Prozesse wie Polarität und Proliferation beeinflussen. Eine veränderte Expression oder Störung von Transportregulatoren wie DENND5B wurde mit fehlregulierten Signalnetzwerken sowie genomischen/funktionellen Veränderungen in verschiedenen Krankheitskontexten beim Menschen in Verbindung gebracht, einschließlich krebsassoziierter Phänotypen. Daher wird DENND5B häufig in Signalwegen untersucht, die die Dynamik des endomembranären Systems mit der Kontrolle von Zellzuständen und der Anpassung an Stress verknüpfen.

DENND5B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DENND5B-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DENND5B Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DENND5B-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DENND5B-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DENND5B-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DENND5B-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DENND5B-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DENND5B-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DENND5B-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.