Plasmide CRISPR d'Activation (h) DDX3X: sc-401253-ACT

DDX3X code une hélicase à ARN conservée de la famille DEAD-box, qui remodèle la structure secondaire de l’ARN ainsi que les complexes ribonucléoprotéiques afin de coordonner plusieurs étapes du métabolisme de l’ARN, notamment la régulation transcriptionnelle, la maturation du pré-ARNm, l’export de l’ARNm, l’initiation de la traduction et la dynamique des granules de stress. Dans les cellules humaines, DDX3X intègre des signaux qui modulent les réponses immunitaires innées et les programmes de stress cellulaire, reliant la détection de l’ARN à des voies associées à l’interféron et au contrôle de la traduction. Des altérations de l’activité ou de l’expression de DDX3X ont été associées à une prolifération dérégulée, à des réponses au stress aberrantes et à des défauts de maintien du génome, ce qui en fait une cible pertinente pour des études mécanistiques en biologie du cancer et dans les troubles du neurodéveloppement. En tant qu’hélicase à ARN multifonctionnelle, DDX3X est souvent utilisée comme nœud pour disséquer la régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique et les interactions entre voies de signalisation.

DDX3X Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DDX3X sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DDX3X Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DDX3X dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DDX3X, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DDX3X. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DDX3X natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DDX3X au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DDX3X dans les cellules tumorales présentant une expression de DDX3X silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.