Plásmido CRISPR de Activación (m) DDIT3/CHOP/GADD153: sc-419970-ACT

Ddit3 codifica el factor de transcripción inducible por estrés DDIT3/CHOP/GADD153, un efector central de la respuesta integrada al estrés y de la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) desencadenada por el estrés del retículo endoplásmico (RE). CHOP forma heterodímeros con miembros de la familia C/EBP para reprogramar programas de expresión génica que influyen en la apoptosis, la autofagia, el equilibrio redox y el control del ciclo celular durante el estrés proteotóxico y metabólico. En células de ratón, Ddit3 se utiliza habitualmente como un marcador molecular del estrés del RE aguas abajo de la señalización PERK–eIF2α–ATF4, y se cruza con vías de disfunción mitocondrial e inflamación. La actividad desregulada de Ddit3 se ha implicado en modelos de enfermedad metabólica, neurodegeneración, lesión tisular y biología tumoral, lo que respalda su uso en estudios mecanísticos de adaptación al estrés y decisiones de destino celular.

DDIT3/GADD153/CHOP El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ddit3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DDIT3/GADD153/CHOP El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ddit3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ddit3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DDIT3/GADD153/CHOP. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ddit3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DDIT3/GADD153/CHOP en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DDIT3/GADD153/CHOP en células tumorales con expresión de Ddit3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.