CUL-5 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401344-ACT

Il gene umano **CUL5** codifica la cullina-5 (CUL-5), una componente di impalcatura dei complessi E3 ubiquitina ligasi cullina-RING che promuovono la poliubiquitinazione e la degradazione proteasomiale di specifici substrati. Attraverso l’assemblaggio con elongina B/C e proteine adattatrici con SOCS-box, CUL-5 regola l’omeostasi proteica, l’intensità della trasduzione del segnale e i programmi del ciclo cellulare e della risposta allo stress controllando la stabilità di intermedi della segnalazione. La segnalazione ubiquitinica dipendente da CUL-5 interseca vie che governano le risposte a citochine e fattori di crescita, influenzando così proliferazione, differenziamento e regolazione dell’immunità innata. Un’espressione deregolata di **CUL5** o un’alterata attività del complesso CRL5 è stata implicata nella biologia del cancro e in altri disturbi legati a un’errata proteostasi mediata dall’ubiquitina.

CUL-5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CUL5 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CUL-5 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CUL5 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CUL5, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CUL-5. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CUL5 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CUL-5 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CUL-5 nelle cellule tumorali con espressione di CUL5 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.