CUG2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417019-ACT

CENPW, noto anche come CUG2, codifica un fattore chiave associato al centromero, necessario per il corretto assemblaggio del cinetocoro e per una fedele segregazione dei cromosomi durante la mitosi. CUG2 partecipa all’organizzazione della cromatina centromerica e sostiene l’integrità del checkpoint del fuso mitotico, collegandosi così alla progressione del ciclo cellulare e al mantenimento della stabilità genomica. Un’alterata espressione dei componenti di centromero e cinetocoro è frequentemente associata ad aneuploidia e deregolazione proliferativa, rendendo CENPW un nodo utile per studiare i meccanismi dell’instabilità cromosomica. Nelle cellule umane, l’alterazione della funzione di CUG2 viene comunemente investigata nel contesto del controllo mitotico, delle risposte al danno del DNA dovute a errori di segregazione e di fenotipi proliferativi rilevanti per il cancro.

CUG2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CENPW senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CUG2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CENPW nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CENPW, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CUG2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CENPW nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CUG2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CUG2 nelle cellule tumorali con espressione di CENPW silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.