Plasmide CRISPR d'Activation (h) creatine kinase-M: sc-401132-ACT

Le gène humain **CKM** code la créatine kinase M, une kinase cytosolique des phosphagènes qui catalyse le transfert réversible d’un phosphate entre l’ATP et la créatine pour produire la phosphocréatine, tamponnant ainsi l’ATP cellulaire et soutenant un renouvellement énergétique rapide. CKM est étroitement associée à la bioénergétique du muscle strié et contribue à l’homéostasie métabolique durant la contraction, en reliant la demande énergétique aux voies de la glycolyse et de la phosphorylation oxydative. Des modifications de l’expression ou de l’activité de CKM sont fréquemment étudiées dans les contextes de lésion musculaire, de myopathies et de stress métabolique, où la dynamique de la phosphocréatine peut refléter des changements de la fonction mitochondriale et de l’énergétique cellulaire. En tant que marqueur de la lignée musculaire et du métabolisme énergétique, CKM est également utilisée pour analyser l’état de différenciation, l’organisation sarcomérique et le remodelage métabolique dans des systèmes modèles.

creatine kinase-M Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CKM sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

creatine kinase-M Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CKM dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CKM, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de creatine kinase-M. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CKM natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de creatine kinase-M au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie creatine kinase-M dans les cellules tumorales présentant une expression de CKM silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.