Plasmide CRISPR d'Activation (h2) CRABP-I: sc-405485-ACT-2

Le gène humain CRABP1 code la protéine cytosolique de liaison à l’acide rétinoïque I (CRABP-I), un transporteur intracellulaire à forte affinité qui tamponne et achemine l’acide rétinoïque tout‑trans afin d’en moduler la disponibilité pour la signalisation dépendante des rétinoïdes. En régulant la distribution et le métabolisme de l’acide rétinoïque, CRABP-I influence des programmes transcriptionnels gouvernés par les récepteurs de l’acide rétinoïque et interfère avec des voies qui contrôlent la différenciation cellulaire, la prolifération et la mise en place des patrons du développement. Des altérations de l’expression de CRABP1 ou de la gestion des rétinoïdes sont impliquées dans la dérégulation de la signalisation de l’acide rétinoïque observée dans divers cancers ainsi que dans des contextes neurodéveloppementaux ou neurodégénératifs, où l’homéostasie des rétinoïdes influe sur le destin cellulaire et les réponses au stress. Les outils d’édition du gène CRABP1 permettent des études mécanistiques de la dynamique du transport des rétinoïdes, des transcriptomes répondant à l’acide rétinoïque et du dialogue entre voies de signalisation dans des modèles cellulaires humains pertinents.

CRABP-I Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CRABP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CRABP-I Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CRABP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CRABP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CRABP-I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CRABP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CRABP-I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CRABP-I dans les cellules tumorales présentant une expression de CRABP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.