Plásmido CRISPR de Activación (m) cPLA₂: sc-422284-ACT

Pla2g4a codifica la fosfolipasa A2 citosólica (cPLA2), una enzima dependiente de Ca2+ y regulada por fosforilación que hidroliza de manera selectiva fosfolípidos de membrana para liberar ácido araquidónico y lisofosfolípidos. Este paso aporta sustrato para las vías de la ciclooxigenasa y la lipooxigenasa, modulando la producción de eicosanoides y la señalización inflamatoria e inmunitaria aguas abajo. La actividad de cPLA2 se integra con la señalización MAPK/ERK, los flujos de Ca2+ y la dinámica del tráfico de membranas, lo que influye en las respuestas de citocinas, el estrés oxidativo y la función de barrera. La desregulación de la señalización PLA2G4A/cPLA2 se ha relacionado con la fisiopatología inflamatoria, las respuestas al estrés metabólico y los procesos neuroinflamatorios, lo que la convierte en un nodo útil para estudios mecanísticos en modelos murinos.

cPLA2 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Pla2g4a sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

cPLA2 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Pla2g4a en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Pla2g4a, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de cPLA2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Pla2g4a y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de cPLA2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía cPLA2 en células tumorales con expresión de Pla2g4a silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.