Plasmide CRISPR d'Activation (h) CHMP4C: sc-404325-ACT

CHMP4C code un composant central de la machinerie ESCRT-III, qui remodèle les membranes lors des étapes tardives du tri endosomal, de la formation des corps multivésiculaires et de l’abscission cytokinétique. CHMP4C s’intègre au point de contrôle de l’abscission afin d’aider à coordonner la séparation finale des cellules avec la ségrégation des chromosomes et l’intégrité du génome, reliant ainsi la fonction d’ESCRT à la progression mitotique et aux voies de signalisation associées aux dommages de l’ADN. Une activité dérégulée d’ESCRT-III peut perturber la down-régulation des récepteurs, le trafic vésiculaire et la fidélité de la division cellulaire, des processus fréquemment étudiés dans le contexte de la tumorigenèse et de l’instabilité chromosomique. Par conséquent, CHMP4C est couramment étudié dans les voies qui gouvernent la scission membranaire, le contrôle du cycle cellulaire et les réponses au stress, lesquelles influencent des phénotypes liés à la prolifération et au maintien du génome.

CHMP4C Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHMP4C sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CHMP4C Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHMP4C dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHMP4C, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CHMP4C. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHMP4C natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CHMP4C au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CHMP4C dans les cellules tumorales présentant une expression de CHMP4C silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.