Plasmide CRISPR d'Activation (h) Ceramide Kinase: sc-404164-ACT

Le gène humain **CERK** code la céramide kinase, une kinase lipidique qui phosphoryle la céramide pour générer la céramide-1-phosphate (C1P), déplaçant l’équilibre des sphingolipides de la céramide pro-apoptotique vers des pools de C1P compétents pour la signalisation. L’activité de CERK soutient le trafic membranaire et la signalisation inflammatoire, et elle interfère avec des voies qui régulent la survie cellulaire, la prolifération et les réponses au stress via la modulation du métabolisme des sphingolipides. En contrôlant l’axe céramide/C1P, CERK influence des processus tels que la production d’éicosanoïdes, le transport vésiculaire et la dynamique du cytosquelette. Une signalisation des sphingolipides dépendante de CERK dérégulée a été impliquée dans des contextes incluant la biologie du cancer, la neuroinflammation et les dysfonctionnements métaboliques, faisant de CERK un nœud pertinent pour des études mécanistiques de la signalisation médiée par les lipides.

Ceramide Kinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CERK sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Ceramide Kinase Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CERK dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CERK, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Ceramide Kinase. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CERK natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Ceramide Kinase au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Ceramide Kinase dans les cellules tumorales présentant une expression de CERK silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.